【Science】黄雄怡/杨云芳/Yi Rao：光催化和酶催化结合实现对映汇聚式苄位C‒N自由基偶联-上海善施科技

最近，约翰霍普金斯大学黄雄怡课题组，和浙江工业大学杨云芳课题组，以及犹他州立大学Yi Rao课题组，合作报道了一种对映汇聚式光铜酶催化苄位C(sp³)‒N自由基偶联反应。该反应中以罗丹明B作光催化剂，以铜基苯丙氨酸羟化酶作酶催化剂，实现N-羟基苯甲酰亚胺酯和苯胺的对映选择性脱羧胺化，得到各种苄位手性叔胺。通过分子模型和机理研究实验，作者认为此酶可容纳铜-苯胺配合物，从而和脱羧所得苄位自由基发生偶联反应。相关研究成果于近期在线发表在Science上。

背景介绍：氮杂化合物广泛存在于生物活性分子、药物分子和功能材料中，因此C(sp³)‒N键构建是有机合成重要研究课题。其中，铜催化C(sp³)‒N自由基偶联，是过去几十年可研究热点。该方法可以通过包括自由基均裂取代的外球机制，或经Cu(III)中间体还原消除的内球机制发生自由基偶联（Fig. 1A）。

与有机合成方法相比，构建C(sp³)‒N键的生物催化方法，在过去二十年也发展迅速。发展出的代表性酶催化剂包括：转氨酶、亚胺还原酶、工程化血红蛋白、黄素酶、非血红素酶等（Fig. 1B）。与有机合成方法相比，生物催化方法可以结合铜催化的底物范围和酶催化的基因可调性和选择性，有望解决传统合成方法无法解决的难题。

此研究工作简介：脱羧胺化是构建C(sp³)‒N键生物催化方法的理想补充，可以将易获取羧酸或其衍生物转化成胺。Gregory C. Fu组（10.1021/jacs.7b07546）、胡喜乐组（10.1038/s41929-017-0023-z）和MacMillan组（10.1038/s41586-018-0234-8）等，都报道过铜催化脱羧C(sp³)‒N键偶联反应。

本文研究团队，受胡喜乐组光报道的铜催化N-羟基苯甲酰亚胺酯（NHPI酯）脱羧C(sp³)‒N偶联工作启发（10.1038/s41929-017-0023-z），结合组内在非血铁红素催化NHPI酯脱羧偶联方面的工作（10.1038/s41929-024-01257-7），进一步发展出一种光催化剂和铜基非血红素酶催化剂结合的、对映汇聚式脱羧胺化反应（Fig. 1C），可以实现C(sp³)‒N键的不对称构建。

（Fig. 1，来源：Science）

可行性研究：作者首先建立了非血红素酶库，并以NHPI酯1a和苯胺2b为模板底物，以罗丹明B（rhodamine B）作光催化剂，开展初始活性筛选。结果发现以源自Chromobacterium violaceum的苯丙氨酸羟化酶（CvPAH）为酶催化剂，能以1.1%收率和10%e.e.值得到理想产物3a（Table S1）。进一步筛选胺发现（Table S2），N-甲基苯胺反应性更好，但苯甲酰胺、苄胺、磺酰胺不发生反应。控制实验表明，移除酶催化剂，反应只能得到外消旋体混合物，验证了此酶的对映选择性控制作用。

基于Fig. 2A的CvPAH活性位点图分析，作者继续筛选组内发展出的多种CvPAH酶变体，最后发现简称CvPAH-aminase的CvPAH F107L/Y130S/W180A/P134L/Y179W酶（Table S4），具有最优催化对映选择性（94%e.e.）。基于此发现，进一步筛选酶当量、光催化剂和当量、铜盐和当量、抗坏血酸浓度、底物摩尔比、缓冲液等参数（详见SI），成功以约96%高收率和94%e.e.得到理想产物3a（Fig. 2B）。

（Table S1 in SI，来源：Science）

（Table S4 in SI，来源：Science）

（Fig. 2，来源：Science）

底物拓展：如Fig. 3A和3B所示，在优选条件下，多种苄酸NHPI酯和苯胺底物，都能以可观收率和对映选择性转化成对应脱羧偶联产物3。在这些底物拓展中，作者发现一级苄酸NHPI酯（3j和3k）反应产率低，非苄酸NHPI酯（1b）和三级苄酸NHPI酯（1c）不发生反应，苄胺4参与的反应只得到酰胺产物未得到理想脱羧偶联产物。此外，其它苄位自由基生成底物，包括其它苄酸酯（9）、肟酯（6）、Katritzky盐（8），也兼容此光酶催化偶联反应得到对应偶联产物（Fig. 3C）。

（Fig. 3，来源：Science）

机理研究：最后，作者研究了此光酶催化对映汇聚式脱羧胺化的反应机理。Fig. 4A的实验发现，随反应时间进行，NHPI酯和产物的e.e.值无变化。结合Fig. 4B的自由基捕获和自由基钟等实验，可以得出此反应中生成了苄位碳自由基。SI中底物和酶蛋白的对接研究进一步发现，CvPAH-aminase的活性结合位点足够大，能容纳下两个底物，这表明苄位自由基可能产生在酶蛋白活性位点内。

基于这些实验，结合SI中开展的光催化剂和各种反应成分间的荧光谱图研究，作者提出如Fig. 4C所示可行性反应机理：包含两个底物的Cu(II)-CvPAH被RhB˙ˉ还原成Cu(I)-CvPAH；光催化剂RhB在光激发下转化成的激发态RhB*，可以氧化Cu(I)-CvPAH，生成Cu(II)-CvPAH和RhB˙ˉ；NHPI酯被还原型RhB˙ˉ活化脱羧生成成苄位自由基，然后和苯胺底物发生自由基偶联生成产物，并再生Cu(I)-CvPAH。

（Fig. 4，来源：Science）

黄雄怡/杨云芳/Yi Rao等人，合作报道了一种光和铜酶结合催化的脱羧C(sp³)‒N偶联反应。作者认为，将各种自由基生成有机合成反应与金属酶催化方法结合，有望实现更多开创性生物催化胺化反应。

论文信息：

Enantioconvergent benzylic C(sp³)‒N coupling with a copper-substituted nonheme enzyme

Xuzhong Shen, Xiahe Chen, Yihang Xiao, Jesse B. Brown, James G. Zhang, Xinyuan Ji, Jinyan Rui, Marc Garcia- Borràs, Yi Rao*, Yunfang Yang*, Xiongyi Huang*

Science, 2025

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