山东大学卞小莹/张友明团队Angew Chem: 两种β-羟基化氨基酸的不同生物合成机制-上海善施科技

非核糖体肽(NRPs)是一类结构多样，生物活性广泛的天然产物，包含D型氨基酸，羟基化氨基酸和非蛋白质氨基酸等多种非天然氨基酸。羟基化氨基酸是由羟化酶催化形成的一类重要的手性模块化合物，β-羟基化天冬氨酸（β-OHAsp）广泛分布于天然产物中，尤其是铁载体类化合物，而β-羟基化组氨酸（β-OHHis）在天然产物中比较罕见。此外，Asp羟化酶和His羟化酶的催化机制至今未知，仅停留在生物信息学预测阶段。

关键词：天然产物，羟化酶，生物合成，非核糖体肽合成酶

近日，山东大学卞小莹教授和山东大学/中科院深圳先进院张友明教授团队，以基因组挖掘发现的新型非核糖体脂肽Glidomides为研究对象，通过生物信息学分析，体内原位敲除和大量的体外酶学相结合的策略，阐明了Asp羟化酶和His羟化酶的催化形成羟基化氨基酸的不同机制。首次确定了非核糖体肽合成酶中Interface结构域（I domain）的功能，通过保守位点E54和D166负责招募羟化酶GlmF，从而行使催化功能。本研究首次阐明了新型 I 结构域在羟基化氨基酸形成中的功能和作用机制，加深了对非核糖体肽合成酶多样性的认识，而且为生物合成单一构型的β-羟基化氨基酸的提供了新思路，有助于设计和改造非核糖体肽合成酶获得更多新型天然产物。该论文被期刊编辑选为Frontispiece（扉页论文，下图）高亮推荐。

取得的研究结果如下：

（1）Glidomides（1-4）是由Schlegelella brevitalea DSM 7029产生的一类新型脂肽，包含一个罕见的羟基化组氨酸（threo-β-OH-L-His），羟基化天冬氨酸（threo-β-OH-D-Asp）及3-氨基吡咯烷-2-酮（S-Apo）。基因簇包含两个双加氧酶基因glmD和glmF，四个非核糖体合成酶（NRPS）核心基因及其他附属基因。

（2）threo-β-OH-D-Asp的生物合成：缩合结构域（C domain）影响模块3中腺苷化结构域（A domain）对不同底物的识别能力；GlmD催化NRPS模块3中的CA₃T₃E蛋白结合的最佳底物L-Asp发生反应，产生β-OH-L-Asp，与终产物1中β-OH-D-Asp相比构型发生了异构。异构化结构域（E domain）处于该基因簇的中部，因此推测E结构域的真正催化底物是硫醇化结构域（T domain）绑定的肽酰，而不是T绑定的氨酰。T绑定的肽酰在体内发生异构化后，经多步模块反应形成终产物1。因此证明了GlmD催化Asp羟基化，且先于异构化。

A₃结构域对底物的识别及LC-MS分析GlmD的体外酶学催化反应。(a) 通过焦磷酸盐释放方法检测A₃结构域对底物的识别；(b) LC-MS分析GlmD的体外酶学催化反应；(c) GlmD催化天冬氨酸羟基化的示意图。

（3）threo-β-OH-L-His的生物合成：I结构域对A₁结构域对底物专一性识别影响不大。GlmF催化NRPS模块1中IA₁T₁蛋白结合的底物L-His发生反应，产生β-OH-L-His，而A₁T₁蛋白则不产。为进一步验证该结果，负责脂肪酸链加载的GlmE蛋白分别与其进行反应，结果显示实验组均可以产生目标产物8和9，但A₁T₁蛋白组中的产量较IA₁T₁蛋白组的产量降低了90%。这一结果表明，I结构域在GlmF催化组氨酸羟基化的形成过程中起着重要作用。

A₁结构域对底物的识别及LC-MS分析GlmF的体外酶学催化反应。(a) 通过焦磷酸盐释放方法检测A₁结构域对底物的识别；(b) LC-MS分析GlmF的体外酶学催化反应；(c) LC-MS分析GlmF和GlmE的体外酶学催化反应；(d) GlmF催化组氨酸羟基化的示意图。

（4）IA₁T₁蛋白与羟化酶GlmF的互作研究：I结构域是缩合结构域的一个新分支，仅包含保守位点Asp，而缺少了保守的催化位点His。I结构域呈V字型，由N端亚结构域和C端亚结构域构成。作者发现R18，R19和R310三个位点阻断了底物结合口袋，保守位点R344的缺失使得T结构域无传递底物的结合位点。因此I结构域不能结合底物且不具有催化活性。突变结果显示，I结构域的突变体E54和D166与GlmF的互作条带消失，且E54和D166致使终产物1和2及体外目标产物8的产量降低。E54和D166在空间位置很近且氨基酸侧链均朝外，因此I结构域是通过保守位点E54和D166介导与GlmF的相互作用。与催化游离氨基酸底物的羟化酶相比，GlmF在结构上呈现一个特殊的entrance helix，推测其在羟基化氨基酸形成过程中与T结构域负责的底物呈递存在相关性。基于以上结果，首次提出组氨酸羟基化产生机制：A₁结构域识别L-His，递送形成T₁-L-His；I结构域通过E54和D166招募羟化酶GlmF；T₁结构域将底物递送至GlmF的底物结合口袋，发生羟基化后，T₁结构域进一步将羟基化底物递送至GlmE的C结构域催化口袋，与脂肪酸链发生缩合。

IA₁T₁与羟化酶GlmF的互作研究及组氨酸羟基化形成机制。(a) IA₁T₁突变体的体外活性检测；(b) IA₁T₁突变体的体内活性检测；(c) I结构域蛋白的结构；(d) IA₁T₁突变体与GlmF的相互作用分析；（e）和（f）羟化酶GlmF和GlmD与游离氨基酸底物的羟化酶的结构比对；（g）和（h）组氨酸羟基化发生机制。

（5）S-Apo的生物合成：硫酯酶结构域（TE domain）通过水解或环化方式从装配线上释放天然产物。体内和体外结果表明，S-Apo可由T结构域绑定的氨基酸底物Dab自发的亲核攻击而形成，无需酶催化。但与此同时，根据体内外相应产物产量的比较，作者推测在Glidomide合成装配过程中TE可能保护或维持T结构域绑定的氨基酸底物Dab不发生环化，待T绑定正确的肽酰产物时，TE可能促进Dab的自由氨基攻击羰基而形成Apo，并释放终产物。

本研究不仅为β-羟基化非天然氨基酸的生物合成提供了研究思路，而且在重新设计并改造NRPS获得更多新型天然产物方面具有指导意义。

作者简介

卞小莹教授主要从事微生物基因组编辑技术、天然产物与合成生物学研究。自加入山东大学微生物技术国家重点实验室以来，逐渐形成了“从使能技术开发加速基因簇挖掘，到生物合成机制解析，再到结构改造”的研究特色。近五年已在Nat Commun、PNAS、Nucleic Acids Res、Angew Chem Int Ed、ACS Catalysis等期刊上发表通讯作者论文30余篇。

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