文献精读：光催化析氧和抗菌仿生修复膜通过HIF1-α途径修复糖尿病创面
2023-06-26
摘要：华中科技大学同济医学院协和医院的郭晓东教授、中山大学化学学院、材料科学与工程学院PCFM实验室的全大萍教授与长江大学第一附属医院的Jialin Yu课题组构建了一种光催化析氧抗菌仿生修复膜用于解决伤口修复问题
首先，将仿生修复膜放入水中。近红外光照射30 min后，使用便携式溶解氧检测仪检测水中溶解氧。测试前用蒸馏水清洗电极，仪表表盘上的读数是溶解氧浓度
Ⅰ型胶原是构成正常成人皮肤的主体（占80%），主要存在于成人皮肤、 肌腱、骨组织。Ⅰ型胶原粗大，在体内构成有横纹的粗径原纤维，是瘢痕组织纤维化的物质基础。在伤口愈合中，若Ⅰ型胶原大量出现，将导致瘢痕结构完全有别于正常的皮肤组织，质地坚硬而没有弹性。胶原蛋白主要由成纤维细胞合成，但成人自身真皮的成纤维细胞只能合成 I 型胶原，这也是人在成长过程中，Ⅲ型胶原占比下降而Ⅰ型胶原占比不断提升的原因。
Ⅲ型胶原则是胎儿和婴儿皮肤的主要胶原蛋白（占60%），主要存在于婴儿皮肤或血管内膜、肠道。Ⅲ型胶原是皮肤中网状纤维的主要组成部分，含量越高纤维束越细，用于支撑皮肤柔嫩度，使皮肤细腻和富有弹性。Ⅲ型胶原含量越高，越能使皮肤细腻柔嫩。在创伤修复中，若Ⅲ型胶原蛋白比例高，则皮肤组织细腻柔滑。III型胶原蛋白可以更好地让伤口恢复，不容易留疤痕
在96孔培养板中加100 μL培养基，接种10 μL菌液，37℃孵育36 h，吸出培养基，每孔用200 μL无菌PBS缓冲液冲洗3次，加100 μL甲醇固定15 min后，将甲醇从培养孔中吸出，自然风干；加入100 μL结晶紫溶液，室温染色5 min。从培养孔中吸出结晶紫染料溶液后，在37℃的烤箱中干燥。充分干燥后，每孔加入100 μL 13%冰醋酸溶液，结晶紫在37 ℃的培养箱中溶解30 min。最后用酶标记仪测定OD值或用荧光显微镜拍照
糖尿病伤口局部血管缺乏，缺损区域产生严重缺氧是创面难以愈合的重要原因。华中科技大学同济医学院协和医院的郭晓东教授、中山大学化学学院、材料科学与工程学院PCFM实验室的全大萍教授与长江大学第一附属医院的Jialin Yu（通讯作者）课题组构建了一种光催化析氧抗菌仿生修复膜（PMP@GFs）用于解决伤口修复问题。通过扫描电镜和透射电镜对PMP@GFs进行表征。用氧传感器测试PMP@GFs的析氧性能。PMP@GFs与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌共培养验证PMP@GFs具有良好的抗菌性能。PMP@GFs与成纤维细胞体外共培养，胶原蛋白和HIF1-α的表达明显增加，血管和神经的线粒体活性明显增强。体内实验表明仿生修复膜治疗糖尿病创面的愈合时间明显缩短，胶原蛋白和析氧性能明显增加，血管再生增强。综上所述，PMP@GFs具有优异的光催化析氧和抗菌性能，能显著促进糖尿病创面的修复。
构建仿生膜的第一步是通过静电纺丝法制备聚己内酯（PCL）膜。然后通过胶原II将MXene@PANI（一种还原剂与聚苯胺的结合）加载到PCL膜上。用PEI（聚乙烯亚胺）将NGF（神经生长因子）和VEGF（血管内皮生长因子）负载在仿生膜上形成多功能光催化仿生修复膜（PMP@GFs）。MXene（还原剂）提供光热抗菌效果；PANI（聚苯胺）在近红外光下与MXene一起产生氧气。VEGF和NGF的释放可以协同促进创面的神经和血管再生，生成的血管可以满足组织的持续供氧。
（A、B） MXene与MXene@PANI的扫描电镜图，PANI与几层MXene成功结合。（C、D）MXene与MXene@PANI的透射电镜图，PANI被负载在单层MXene上。（E-I） MXene@PANI的EDS-Mapping图显示C/N/Ti元素。（J） MXene@PANI中的C/N/Ti元素含量。以上结果证实成功合成了MXene@PANI。
（A-C）PCL/PM/PMP@GFs的扫描电镜。A为PCL电纺丝膜、B为PCL电纺丝膜装载少量层MXene （PM）、C为加载MXene@PANIVEGF和NGF的电纺丝膜（PMP@GFs）。（D-H）PMP@GFs的EDS-Mapping图谱，成功合成PMP@GFs。（I）MXene与MXene@PANI的吸收光谱，MXene@PANI的吸收光谱在近红外波段增加。（J）PM与PMP@GFs的吸收光谱，PMP@GFs在近红外光下的吸收光谱明显增加。（K） MXene@PANI的光电效应，表明MXene@PANI在近红外光区能够吸收更多的光子，然后利用光电效应产生光电电流。以上结果表明成功合成了PMP@GFs。
（A-F、H）PCL/PM/PMP@GFs的光热效应、截面温度统计与光热循环。测试PMP@GFs仿生膜的光热效应。在9 s内温度达到52 ℃，而PCL组的温度约为30 ℃，在6 s内还原至初始温度。（G）对PCL/PM/ PMP@GFs进行析氧实验，产氧量可以达到6.6 mg/L。
（A、B、K、L）对PMP@GFs的抗菌性能进行测试。用PMP@GFs共同培养金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，PMP@GFs对金黄色葡萄球菌的杀伤效率达到95%。PMP@GFs对大肠杆菌的杀伤效率达到98%。（C、D）PMP@GFs的抗金黄色葡萄球菌与抗大肠杆菌效果。（G、H）金黄色葡萄球菌与大肠杆菌生物膜光镜图。（M、N）对PMP@GFs的抗菌生物膜性能进行测试，PMP@GFs减少到PCL组的0.17倍。PMP@GFs仿生细菌膜生物膜的形成减少到PCL组的0.15倍。（E、F）观察PMP@GFs培养金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的变化。用扫描电子显微镜监测培养的细菌，金黄色葡萄球菌表面破损，PM仿生膜组中金黄色葡萄球菌的性状表面有特异性的凹陷。在PMP@GFs中大肠杆菌的结构被破坏，在PM中有一定的损伤。（I、J）检测细菌的活/死染色，与PCL组相比，PMP@GFs组死菌较多。
成纤维细胞是真皮的原代细胞，在皮肤创面愈合过程中起着至关重要的作用。（A、H）成纤维细胞标记物Vimentin的免疫荧光染色，将仿生膜与成纤维细胞共培养，统计结果图表示PMP@GFs组是PCL组的2.76倍。（B、I）PMP@GFs组I型胶原的表达量是PCL组的2.03倍。（C、J）对于III型胶原的加入，PMP@GFs组是PCL组的4.11倍。（D、K）成纤维细胞HIF1-α表达的检测，PMP@GFs组是PCL组的1.49倍。以上结果表明PMP@GFs仿生膜能够促进胶原I和胶原III的表达。（E、L）[Ru(DPP)3] Cl2遇氧猝灭，反映氧含量。PMP@GFs组的荧光强度是PCL组的0.59倍。（F）氧在有氧呼吸中起着至关重要的作用，而线粒体是必不可少的参与者，使用JC-1试剂盒检测线粒体膜电位。PMP@GFs的线粒体变长，这可能是导致成纤维细胞活性增强和胶原分泌增加的机制之一。
（A）将PMP@GFs与HUVECs共培养，检测细胞内的线粒体，发现PMP@GFs组细胞的线粒体明显增加，荧光强度也明显增加。（B、H）PMP@GFs组的荧光强度是PCL组的0.49倍。（C、I）PMP@GFs组CD31的表达量是PCL组的2.09倍。以上证实PMP@GFs仿生膜可以增强血管内皮细胞的活性。（D-F、J）神经再生在伤口修复过程中也很重要。将PMP@GFs与PC12细胞共培养。PMP@GFs仿生膜组的NF200染色明显增强，是PCL组的2.87倍。（G）检测细胞中的线粒体，PMP@GFs组细胞的线粒体明显增加，荧光强度也明显增加。以上表明PMP@GFs仿生膜在伤口修复过程中对神经和血管的调节具有重要作用。成纤维细胞和HUVEC的线粒体形态延长，其中PC12细胞的线粒体形态延长最为明显，PC12线粒体可能在促氧糖尿病创面愈合中发挥重要作用。
（A-G、U）将仿生膜植入糖尿病大鼠伤口部位。PMP@GFs组创面愈合效果在第14天最好。PMP@GFs组创面面积明显小于PCL组，为初始创面面积的0.17倍。（H-J）对PMP@GFs仿植入后的光热效应进行测试。植入PMP@GFs部位升温最快，在9 s内升至65 ℃。对照组在此过程中仅升温至32 ℃，PCL升温速度明显慢于PMP@GFs组。（K-P）对PMP@GFs修复后皮肤的HE和MASSON染色，PMP@GFs组可以改善创面，对皮肤真皮层和表皮有明显的修复作用。（V）PMP@GFs组胶原蛋白含量明显增加，是PCL组的2.30倍。（R-T、W）对创面血管内皮进行免疫荧光染色。PMP@GFs组显著促进血管的形成，是PCL组的2.55倍。以上实验表明PMP@GFs仿生膜在体内能够促进糖尿病伤口的修复和血管的再生。
光催化析氧和抗菌PMP@GFs在近红外照射下释放氧气，并利用光热效应清除创面中的细菌。在体外，光催化析氧和抗菌PMP@GFs能促进成纤维细胞、血管内皮细胞和神经细胞的活性。在体内，光催化析氧和抗菌PMP@GFs可以释放包括VEGF和NGF在内的生长因子，促进血管和神经的再生，最终达到糖尿病伤口修复的作用。光催化析氧和抗菌PMP@GFs为糖尿病伤口的修复提供了一种新的治疗方法。
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