摘要：杨课题组通过对可见光的光氧化还原催化和PLP生物催化协同耦合的深入研究，提出了以下催化机制：光催化生成的自由基中间体被酶催化生成的由吡哆醛衍生的共价中间体捕获，从而使分子间形成立体选择性的C-C键。与之前研究的自然和非自然光酶催化不同，本文中的协同光氧化还原-吡多醛生物催化将光诱导自由基形成和酶促自由基拦截在两个离散的催化循环中。
今天给大家分享一篇发表在Science的文献，文章的标题为“Stereoselective amino acid synthesis by synergistic photoredox-pyridoxal radical biocatalysis”，通讯作者是加州大学圣塔芭芭拉分校的杨扬教授。
开发生物化学和有机化学中未知的合成酶反应是生物催化领域的一个重要挑战。通过光氧化还原催化和吡哆醛5 '-磷酸(PLP)生物催化的协同合作，为非天然氨基酸的高效制备提供了新颖的合成策略；使用工程化的PLP酶，两种对映体产品都可以在生物催化剂控制下生产。这种协同光氧化还原-吡哆醛自由基生物催化同时为发现以前未知的催化反应和驯服不对称催化的自由基中间体提供了一个强大的平台。
图1. 文献概览
杨课题组通过对可见光的光氧化还原催化和PLP生物催化协同耦合的深入研究，提出了以下催化机制：光催化生成的自由基中间体被酶催化生成的由吡哆醛衍生的共价中间体捕获，从而使分子间形成立体选择性的C-C键。与之前研究的自然和非自然光酶催化不同，本文中的协同光氧化还原-吡多醛生物催化将光诱导自由基形成和酶促自由基拦截在两个离散的催化循环中。由于不依赖于酶的辅助因子的光化学性质，这种策略可以为自由基生物催化的进一步发展创造机会。后续研究将设计重点放在能够官能团化丝氨酸及其衍生物β位的PLP酶上。最初，光氧化还原催化剂(IV)在可见光照射下会产生激发态光氧化剂(IV*)。通过IV*对烷基三氟硼酸盐底物I进行单电子氧化，将产生碳中心自由基(VI)和还原光催化剂V。与此光氧化还原催化循环的同时，β位官能团化的PLP依赖性酶(VII)，如色氨酸合成酶，将丝氨酸和其他β-羟基-α-氨基酸(II)通过一系列已建立的天然中间体(VIII至X)转化为亲电性氨基丙烯酸酯(X)。随后的电子转移/质子转移(ET/PT)或质子耦合电子转移(PCET)涉及还原的光催化剂V将提供外部醛胺XII，其水解后将释放产物III。
图2. 催化机理
该课题组从评估β位官能团化PLP酶与光氧化还原催化剂对天然底物自由基β碳功能化的协同作用开始了这项研究。选择苄基三氟硼酸钾盐作为模型底物，是因为其相对较低的氧化还原电位(与MeCN中饱和甘汞电极相比为1.09 V)和所产生的苄自由基的稳定性较强。通过对PLP酶突变体和光催化剂的条件筛选，确定了最佳反应条件，并以73%的收率和93:7的er值获得C-C键偶联产品。对于L-PfPLPbβ，将水缓冲液的pH从6.0增加到8.0导致对映体选择性降低。在pH 8.0下进行该反应，生成几乎外消旋的3a (49:51 er)。后续工作中测试了一个小的PLP酶变体库，发现L-PfPLPbβ的单突变体E104G逆转了对映体选择性，该L-PfPLPbβ E104G称为D-PfPLPβ。值得注意的是，使用D-PfPLPbβ的生物催化被发现对反应体系的pH值不敏感，在较高的pH值下对映选择性略有增加。在优化条件(pH =7)下，D-PfPLPbβ以79%的产率和6:94的er值生成对映体产物D-苯丙氨酸衍生物D-3a。在对消旋体2a的生物催化中发现，L-PfPLPbβ可以接受D-丝氨酸作为底物，形成L-3a产物的活性较低，但D-PfPLPbβ对D-丝氨酸几乎没有活性。
图3. 条件筛选
图4. PLP酶变体库的筛选
在优化了反应条件后，作者进行了一系列的底物拓展。当使用L-PfPLPbβ或者D-PfPLPbβ时，对位、间位和邻位取代的苯基底物获得了均匀优异的对映体控制水平(3a至3l)，并且甲酯(3h)和氰基(3i)等官能团是耐受的。此外，缺电子(3f, 3g, 3h和3i)和富电子(3j)的苄基三氟硼酸盐都能以优异的对映选择性顺利转化，具有苯二唑(3k)和萘基(3l)核心的体积较大的双环底物也被酶接受。出乎意料的是，使用D-PfPLPbβ得到的3m主要对映体是L构型。
图5. 底物拓展
苏氨酸(2b)作为廉价且容易获得的构建模块很容易被L-PfPLPbβ接受，在这种双催化过程中以优异的产率和立体选择性提供具有相邻α和β立体中心的异亮氨酸类似物(4a至4e)。使用外消旋仲烷基自由基前体[(rac)-1p]的对映收敛转化导致ncAAs（非天然氨基酸）具有三个相邻的立体中心(5a)，具有出色的非对映选择性和对映选择性。在具有三个连续手性中心产物5a的形成过程中，1p在不同的转化率下回收的底物er值均为50:50，这表明(rac)-1p的动力学拆分是不参与其中的，这一结果同时也证实了该过程的对映收敛性质。最后，L-PfPLPbβ能够利用过量的外消旋dl -苏氨酸[(rac)-2b]产生对映体富集产物，其产率和对映纯度几乎相同。值得注意的是，目前还没有具有三个连续手性中心的化合物5的合成方法。因此，这种协同催化方法代表了一种综合价值的进步，可以在一次操作中获得具有多个相邻立体中心的ncAAs。最后，通过对其N-酰化产物6a、6b和6c的X射线单晶衍射分析，确定了C−C偶联产物3a、4a和5a的相对构型和绝对构型。
图6. 底物拓展与构型确认
此外，紫外可见光谱分析表明：与先前报道的黄素依赖的烯还原酶的非自然光酶催化不同，底物和酶中间体之间的电荷转移复合物可能不参与目前的吡多醛自由基生物催化。
图7. 紫外可见光谱分析
为了进一步阐明β官能团化的反应机制和区域选择性的起源，作者使用由与丝氨酸结合的工程色氨酸合成酶[PDB 5VM5]的先验结构制备的酶模型进行了密度泛函理论计算，其中包括了与催化相关的氨基酸残基K82、D300以及PLP辅因子3.0 Å范围内的其他氨基酸残基。
图8. DFT计算
从外部醛胺7开始，赖氨酸残基K82 (TS-1)发生去质子化，形成醌类中间体8。类喹诺酮8的β-羟基消除是由酸性的天冬氨酸残基D300促进的，导致关键的氨基丙烯酸酯物种10相对于8具有16.0 kcal/mol的激活能垒。光氧化还原催化循环生成的苄基自由基9通过TS-3加成到氨基丙烯酸酯10的β碳上，具有较低的激活能垒，产生氮杂烯基自由基中间体11。这个氮杂烯基自由基11然后经历ET/PT，产生外部醛胺13。根据Marcus理论计算，烯丙基自由基11与还原光催化剂[RhB]•−之间的ET(可能是通过远程ET)在动力学和热力学上都是可行的。接下来的PT步骤(TS-4)的能垒相对较低，为16.0 kcal/mol。
图9. DFT计算
过渡态计算还揭示了在苄基自由基(9)加入氨基丙烯酸酯10的过程中，蛋白质支架在控制区域选择性方面的关键作用。总结：杨扬课题组利用光氧化还原-吡哆醛自由基生物催化的手段成功实现了非天然氨基酸的立体选择性合成，并为生物催化合成反应开辟了新的思路。
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